Nitroglycerin có thể được điều chế bằng nitrát hóa glycerin. Theo cách này, trộn Axit sulfuric và Axit nitric đặc với glycerin theo tỷ lệ 50%, 40%, 10%. Đầu tiên trộn hai axit trước, rồi làm lạnh đến 10 °C, đặt hỗn hợp trong có nước đá đang tan rồi trộn glycerin từ từ vào. Không được để hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ cao sẽ gây nổ, cũng không được để nhiệt độ quá thấp nếu không phản ứng dừng lại. Khi phản ứng xong, nitroglycerin màu vàng nhạt nổi lên, đổ từ từ vào chậu nước lớn, nitroglycerin chìm xuống đáy chậu. Tách ra và trung hòa dần bằng muối kiềm, như natri cacbonat.

Một cách nữa để điều chế nitroglycerin là trộn glycerin với axit sunfuric trước, hỗn hợp nóng lên và dược làm lạnh trước, đến đây thì có thể đổ nhanh axit nitric vào. Tuy nhiên, vẫn phải cẩn thận không dung dịch bắn ra. Cũng có thẻ trộn thêm glycerin thật chậm vào. Sau khi phản ứng nitrat hóa glycerin diễn ra, nitroglycerin nổi lên trên, phương pháp này điều chế được chất tinh khiết. Đợi có thể đến một ngày hay ít hơn, nhưng kéo dài thời gian ngâm có thể làm axit phân hủy hoặc kích nổ nitroglycerin, tuy sau này chỉ xảy ra ở các mẻ lớn. Nếu có màu sữa thì chỉ có thể là nước, từ điểm đó lên trên. Phương pháp này dùng từ thời Alfred Nobel, nhưng không phải của ông.